一、母种制作
鸡腿蘑菌种主要采用组织分离法得到纯菌种。鸡腿蘑菌丝在PDA培养基(马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，加水至1000毫升)上生长良好。在以下加富培养基或麦粒煎汁培养基上菌丝生长得更好。
1、马铃薯200克、葡萄糖20克、硫酸镁1.5克、磷酸二氢钾1.5克、磷酸氢二钾1.5克、维生素B110毫克、琼脂20克，加水至1000毫升。
2、小麦200克，浸泡10小时，煮30分钟，滤汁，加葡萄糖20克、蛋白胨3克、硫酸镁0.5克、磷酸二氢钾1.0克、维生素B10.2克、琼脂20克，加水至1000毫升。
3、小麦250克，浸泡10小时，煮30分钟，滤汁，加马铃薯150克、葡萄糖20克、蛋白胨2克、硫酸镁1.5克、磷酸二氢钾1.5克、维生素B110毫克、琼脂20克，加水至1000毫升。菌丝最初白色，然后变成灰白色，培养基的颜色也随之加深。在恒温箱中，25℃条件下菌丝在7―10天可长满斜面，最快的5―6天。
二、原种制作
采用稻草、棉籽壳、杂木屑三种原料为主制作培养基和用麦粒制作培养基。试验证明，鸡腿蘑的菌丝在这几种培养基上都可以正常生长，但在以麦粒和棉籽壳为主的培养基上生长最好。各种原种培养基的配方如下：
1、稻草培养基稻草(切段或粉碎)60%、麸皮25%、玉米粉8%、复合肥5%、糖1%、石灰1%。
2、棉籽壳培养基A棉籽壳90%、麸皮4.5%、玉米粉4.5%、石灰1%。
3、棉籽壳培养基B棉籽壳87.5%、麸皮10%、尿素0.5%、石灰2%。
4、棉籽壳培养基C棉籽壳78%、麸皮10%、玉米粉5%、复合肥5%、糖1%、石膏1%、维生素B1微量。
5、木屑培养基杂木屑75%、麸皮15%、玉米粉8%、糖1%、石膏粉1%、维生素B1微量。
6、麦粒培养基麦粒加水，浸泡10―15小时，加1%石灰粉煮沸30分钟(至无白心，而皮不破)，稍晾后装瓶。
以上培养基的含水量均控制在60%―65%，所有培养基均保持自然pH值，按常规方法装瓶，塞棉塞，常压或高压蒸汽灭菌。冷却后，在无菌箱或无菌室中无菌操作接入母种，置于24―26℃的温室或温箱中培养。经30―35天鸡腿蘑菌丝就可以长满全瓶。除固体菌种外，鸡腿蘑的原种也可以用液体培养基进行培养，制成液体原种。在各母种培养基配方中取消琼脂，即可作为液体培养基配方。
鸡腿蘑菌种的好坏对子实体的产量影响甚大，应加以注意。菌株不同，菌丝的形态也不完全一样。有的菌株起初是线状的，后来逐渐产生气生菌丝；有的菌株起初是棉絮状，后来逐渐变成线状，色泽为白色或灰白色。好的菌种利用培养料的能力强，菌丝生长较快。
三、栽培种制作
1、栽培种培养基
①同上述原种培养基配方。
②杂木屑78%、麸皮20%、碳酸钙1%、蔗糖1%，料水比为1：1.5，pH值自然。
③蘑菇堆肥28%、木屑60%、麸皮12%，料水比1：1.4―1.5，pH值自然。
2、制作方法栽培种的培养容器采用聚丙烯塑料薄膜袋(长34―36厘米，宽14―17厘米，厚度0.05―0.06厘米)。
①具体操作。选用上述培养基配方，按要求把原辅材料备好，加水搅拌均匀，然后装袋。
装袋时先抓2―3把培养料装进袋中，用手把袋底的边角压入袋内，并压紧培养料使之成圆柱形，袋底平稳能直立于地面。在袋中插入圆形木棒或直径2―2.5厘米的试管，最好插到底，但应避免刺破袋子，而后继续边装料边用手压实，装至袋长的2/3(约500克干料)，压平表而，拔出木棒或试管。这样预埋管(棒)再装斜，拔出后留下的洞穴坚固、在搬运过程中不易堵塞，灭菌时蒸汽容易穿透培养料，灭菌能更彻底，而且接种时原种落入洞底，加速菌丝生长、缩短栽培种培养时间。培养料装好后，将袋口及表面弄干净，在袋口上套上硬塑料套环(内径3.5厘米，高3.5厘米)，让袋口薄膜从环内通过，并向外顺环壁朝下翻转，然后将袋口整平，塞上棉塞，进锅灭菌。为防止棉塞受潮，进锅后每层塑料袋上方都要盖牛皮纸。以1.5公斤/平方厘米的蒸汽压力灭菌1.5小时，或常压蒸汽灭菌8―10小时，灭菌后取出冷却。
②接种与培养。栽培种也应在无菌箱或无菌室内按无菌操作要求接种，然后与原种同样条件进行培养。
